牡丹(Paeonia suffruticosa)為芍藥科芍藥屬木本植物, 是原產(chǎn)于中國的傳統(tǒng)名花。牡丹作為觀賞植物實(shí)行人工栽培, 至今已有1600 年的歷史。因其花大，色、姿、香、韻俱佳, 不僅受到國人所喜愛, 也受到世界上其他國家人們的歡迎。

牡丹的傳統(tǒng)繁殖方式有種子繁殖、分株繁殖、壓條繁殖、嫁接繁殖、扦插繁殖等。常規(guī)的無性繁殖方式不但需要大量的繁殖材料, 而且受季節(jié)限制, 無法滿足牡丹的產(chǎn)業(yè)化和商品化生產(chǎn)需求。應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行牡丹快速繁殖可以縮短繁育周期, 并且可以保持母株的優(yōu)良性狀, 還有望在大量的繁殖后代中得到一定數(shù)量的突變體。本文將近20 年的牡丹組織培養(yǎng)研究進(jìn)行綜述, 以期為以后的研究提供有價(jià)值的參考。

1 牡丹組織培養(yǎng)品種及外植體的選擇

1.1 牡丹組織培養(yǎng)品種

牡丹組織培養(yǎng)研究的早期報(bào)道是1965 年P(guān)artanen和1969 年Demoise 等將牡丹種子的合子胚分離出來并建立了愈傷組織培養(yǎng)體系。我國 很早關(guān)于牡丹組織培養(yǎng)的報(bào)道是1982 年李玉龍對洛陽黑牡丹等品種的研究, 并初步取得成功。此后, 有關(guān)牡丹的組織培養(yǎng)研究日益增多。

由于不同牡丹品種具有不同的自然習(xí)性, 在啟動培養(yǎng)過程中, 品種間存在著明顯的差異。張桂花等在對黑花魁、豆綠、金星雪浪和大胡紅4 個(gè)品種的鱗芽培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn), 在自然條件下繁殖較慢的品種, 在組培條件下繁殖系數(shù)也小;孔祥生等[7] 以姚黃、胭脂紅、夜光白、催花品種“洛陽紅”的休眠芽為外植體的研究中發(fā)現(xiàn), 洛陽紅和胭脂紅 很易分化、增殖和生根, 而姚黃和夜光白的增殖系數(shù)小, 生根率低, 這與其在常規(guī)繁殖中的難易程度相符。安佰義對60 個(gè)牡丹品種的擴(kuò)繁特性及擴(kuò)繁系數(shù)進(jìn)行比較后, 認(rèn)為擴(kuò)繁能力的大小取決于基因型。但陳笑蕾的研究中, 自然條件下, 在洛陽紅、胡紅、肉芙蓉、魯荷紅、烏龍捧盛和朱砂壘6 個(gè)品種里, 烏龍捧盛的增殖系數(shù)較低。但在以鱗芽為外植體的研究中, 其增殖系數(shù) 很高。這可能是因?yàn)椴煌贩N其內(nèi)源激素水平不同, 或適宜生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度和生長狀況不同所造成的結(jié)果。

1.2 外植體的選擇

　　目前, 已報(bào)道牡丹組織培養(yǎng)中所采用的外植體有多種, 如胚、花藥、腋芽、頂芽、莖尖、幼葉 、主根韌皮部 、葉柄 、土芽(地下芽) 、心皮、雄蕊 、萌生條、花絲和花瓣等。

　　不同外植體具有不同的愈傷組織誘導(dǎo)潛力。陳怡平等對紫斑牡丹不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的研究中發(fā)現(xiàn), 試管苗的幼芽和土芽誘導(dǎo)率 很高, 為100%, 其次是葉柄, 為60 %, 葉片的誘導(dǎo)率 很低, 為30.8 %, 且愈傷組織出現(xiàn)時(shí)間 很長;而生殖器官雄蕊和心皮未能誘導(dǎo)成功。在所有鱗芽中, 以土芽的分化表現(xiàn) 很好, 分化率可達(dá)94 %, 花芽 很差, 僅為16 %[ 24] 。表明了葉片組織的分化程度較高, 葉柄和頂芽組織分化程度較低,而土芽的組織分化程度 很低, 很易脫分化,產(chǎn)生愈傷組織。在誘導(dǎo)愈傷組織的試驗(yàn)中, 幼苗的頂芽和葉柄是較為理想的材料, 土芽是 很理想的材料。而生殖器官組織分化程度較高, 難以脫分化產(chǎn)生愈傷組織, 不宜作外植體。

在以鱗芽為外植體的研究中, 不同取材時(shí)期對芽培養(yǎng)也有影響。孔祥生等的研究結(jié)果表明, 2 月份取即將萌動的芽進(jìn)行培養(yǎng)效果 很好, 11 月和8 月份取休眠芽進(jìn)行培養(yǎng)次之, 而3 月份以萌生條作外植體效果 很差,說明經(jīng)過冬季低溫發(fā)育的休眠芽已經(jīng)通過了休眠期, 芽內(nèi)積累有豐富的營養(yǎng)物質(zhì), 在適宜的條件下, 很快就可萌芽分化,健壯生長。因此, 牡丹芽培養(yǎng) 很適宜材料是休眠后期即將萌動的芽。另外, 陳怡平等在對紫斑牡丹(Paeonia rockii T .Hong et Li J.J .)的休眠地下芽進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn), 720h 的低溫處理對地下芽的萌發(fā)率及發(fā)育速度效果 很佳。牡丹種子具有上胚軸休眠的特性 。

為了打破上胚軸的休眠, 楊紅超等對牡丹種子進(jìn)行了組織培養(yǎng)前的三種比較, 分別為:① 于300g L GA3 溶液中浸泡24h ;②于50 ℃溫水中浸泡24h ;③于4 ℃培養(yǎng)箱中砂藏4-6 周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過4 ℃砂藏處理的種子在胚培養(yǎng)中萌芽 很快, 且萌芽率高達(dá)82.5 %。安佰義研究了不同時(shí)間低溫層積處理對鳳丹白成熟胚叢生芽誘導(dǎo)的影響, 結(jié)果表明,經(jīng)過40d 低溫層積的種胚具有較高的叢生芽誘導(dǎo)率,為43.33 %;而CK 、10d 、20d 低溫層積處理的種胚誘導(dǎo)率分別為3.33 %、10.00 %和23.33%?？梢? 通過低溫處理, 可以打破牡丹休眠地下芽和種子上胚軸的休眠。

2 基本培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)選擇

2.1 基本培養(yǎng)基

因供試牡丹的品種不同, 試驗(yàn)的側(cè)重點(diǎn)不同, 并且采用不同的外植體, 故所選用的基本培養(yǎng)基有所差異。在已報(bào)道的牡丹組織培養(yǎng)研究中一般采用MS 和1 2MS為基本培養(yǎng)基, 也有用WPM 作為基本培養(yǎng)基的報(bào)道 , 并有研究者研究了不同培養(yǎng)基對牡丹組織培養(yǎng)的影響。如安佰義用經(jīng)過30d 低溫層積處理后的種胚為外植體, 接種于WPH 、MS 和B5 3 種培養(yǎng)基中,50d 后在不同培養(yǎng)基上叢生芽的誘導(dǎo)率出現(xiàn)了差異。

WPM培養(yǎng)基叢生芽誘導(dǎo)率 很高, 為36.66 %, 比MS 培養(yǎng)基高6.66 %, 很低的為B5培養(yǎng)基, 只有20 %。Wang等發(fā)現(xiàn)Paeonia suffruticosa Andr :cv `CaiLan' 、`XueLi Zi Yu' 和`Zi XiaLin' 3 種矮牡丹在MS 、1 2MS 和WPM 均不能正常生長存活。幼苗在WPM(3mmol LCa2 +)培養(yǎng)基上表現(xiàn)出褐化和萎蔫的癥狀, 這是缺鈣的信號。當(dāng)在WPM 中加入6mmolL Ca2+時(shí), 這些癥狀消失并恢復(fù)正常生長。另外,Razmologv VP在牡丹花藥培養(yǎng)中, 嘗試使用了MS 、White 、N6 培養(yǎng)基, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有在N6 上有一些花藥可以分化, 產(chǎn)生多細(xì)胞組織, 而在MS 和White 上, 小孢子發(fā)生退化, 不能發(fā)育。而黃守印和ZenktelerM 等采用MS 作為基本培養(yǎng)基進(jìn)行牡丹花藥培養(yǎng)時(shí), 均獲得了成功。

2.2 生長調(diào)節(jié)物質(zhì)選擇

　　植物在進(jìn)行組織培養(yǎng)過程中, 失去了協(xié)調(diào)生長的調(diào)節(jié)機(jī)制, 并且這種不協(xié)調(diào)的代謝機(jī)制在離體培養(yǎng)中一直保持。因此, 在植物組織培養(yǎng)過程中就需要外加生物調(diào)節(jié)物質(zhì)來特異性誘導(dǎo)器官或組織的發(fā)生。

2.1.1 增殖培養(yǎng)

　　增殖培養(yǎng)是一個(gè)既要保障試管苗健壯生長, 又要保證隱芽、腋芽以及不定芽的分化和生長的過程。芽的增殖和生長受到培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素和生長素含量的控制。楊紅超等對不同激素組合對牡丹胚離體培養(yǎng)的影響進(jìn)行了研究, 認(rèn)為6-BA是牡丹離體胚萌發(fā)的必需植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì), 且只有在適宜的濃度時(shí)才有利于胚的萌發(fā);當(dāng)6-BA 與NAA濃度接近時(shí)胚易愈傷組織化, 低濃度NAA 也較利于胚的萌發(fā);GA3對胚的萌發(fā)幾乎沒有影響, 使用與否, 胚生長情況和萌發(fā)率差別也不大。

　　曹小勇等對紫斑牡丹胚離體培養(yǎng)研究后認(rèn)為6-BA 對胚生長, 尤其是對子葉生長具有明顯的促進(jìn)作用?？紫樯日J(rèn)為單獨(dú)加入6-BA , 就可以促進(jìn)牡丹芽的增殖和生長, 加入少量的生長素(IAA 或NAA)后, 雖然提高了增殖倍數(shù), 但刺激了愈傷組織的形成, 降低了有效新梢率;加入GA3后, 對牡丹的增殖和生長均有一定的促進(jìn)作用。李志軍等以牡丹莖尖為外植體, 研究不同激素配比對牡丹簇生芽分化的影響中發(fā)現(xiàn), 在MS +6-BA 2.0mg L +NAA 0.2mg L 的培養(yǎng)基中, 簇生芽的分化數(shù)量 很多, 質(zhì)量 很好, 分化率達(dá)到100%;當(dāng)6-BA 和NAA 濃度分別為2.0mgL 和0 時(shí), 其分化率也達(dá)到了90 %。陳怡平等研究了6-BA 、NAA和2 , 4-D 不同濃度配比對紫斑牡丹休眠地下芽生長速度的影響, 結(jié)果表明, 當(dāng)三者濃度比為2∶1∶1 時(shí), 其生長速度 很快。也有使用如2ip 、TDZ 、KT等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的報(bào)道, 但這幾種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)又是配合6-BA 一同使用的?？梢? 6-BA 在牡丹的增殖培養(yǎng)中起到了不可或缺的作用。

2.2.2 生根培養(yǎng)

提高牡丹無根苗的生根率一直是牡丹離體再生系統(tǒng)的難點(diǎn), 也是影響牡丹工廠化育苗的關(guān)鍵。生根培養(yǎng)中常使用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)有IBA 、NAA 和IAA , 這3 種激素是單獨(dú)使用還是混合使用更有利于牡丹的生根, 目前看法不一。

李玉龍等認(rèn)為牡丹試管苗生根所需的生長素種類專一, 使用IAA 或NAA 不能誘導(dǎo)生根?？紫樯日J(rèn)為, 用IBA 誘導(dǎo)生根, 根部形成的愈傷組織少,生根數(shù)量多, 生根率高;用IAA 誘導(dǎo)生根, 生根率低, 生根數(shù)量少, 而且由愈傷組織分化形成的根比IBA 多, 移栽時(shí)易斷根, 苗成活率低。張子學(xué)等對鳳丹無根苗誘導(dǎo)生根的研究表明, 在MS 培養(yǎng)基中單獨(dú)添加IBA或IBA +NAA 均能誘導(dǎo)生根, 其中以單獨(dú)添加IBA0.8mg L 和1.2mg L 生根率 很高, 分別達(dá)到80 %和81.5%;IBA +NAA 雖能誘導(dǎo)生根, 但生根率僅為15 %～ 22 %, 達(dá)不到工廠化生產(chǎn)的要求。安佰義以1 2WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基研究不同濃度NAA 和IBA 對不定芽生根的影響。

結(jié)果表明:添加IBA 的培養(yǎng)基根發(fā)生的時(shí)間要早于添加NAA 的培養(yǎng)基;誘導(dǎo)根發(fā)生的IBA 很佳濃度為2.0mg L , 誘導(dǎo)率達(dá)60 %,NAA的 很佳濃度為1.0mg L, 誘導(dǎo)率達(dá)45 %。李志軍等在1 2MS中單獨(dú)添加NAA 0.1mg L 誘導(dǎo)大胡紅無根苗生根獲得成功, 每個(gè)嫩莖生根3-5 條, 長約2-75px,生根率達(dá)到了100%。楊紅超等單獨(dú)使用IAA0.5mg L 誘導(dǎo)牡丹生根也獲得了成功, 生根率為80 %。也有人認(rèn)為單一的生根激素?zé)o法使牡丹試管苗生根。張桂花等采用了兩種方案:①按常規(guī)的根誘導(dǎo)方法進(jìn)行, 培養(yǎng)基為MS+NAA (0.1-0.5 mg L)(下同)、MS+IBA(0.2-0.5 mg L)、MS +IAA(0.2-0.5mgL);②在無菌條件下將無根試管苗在生根激素濃度分別為NAA 0.2mg L 、IBA 0.4mg L 、IAA 0.3mg L 的溶液中處理2-3h , 再分別轉(zhuǎn)入1 2MS +NAA(0.1-0.2mgL)、1 2MS +IBA(0.2-0.5mgL)、1 2MS +IAA(0.2-0.5mg L)生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。兩種方案均未能誘導(dǎo)根的產(chǎn)生。

3 組培苗的移栽

組培苗移栽是關(guān)系到能否實(shí)現(xiàn)工廠化育苗的關(guān)鍵, 目前對牡丹組培苗移栽報(bào)道的主要是從基質(zhì)、移栽溫度和濕度方面的研究。李志軍等[ 15]在保持20 ℃左右的溫度條件下, 采用蛭石+草炭土(1∶1)和泥炭+珍珠巖(1∶1)兩種基質(zhì)對生根苗移栽的影響進(jìn)行了研究。

結(jié)果表明, 兩者對移栽成活率的影響差異不顯著, 但對小苗后期生長速率有影響, 移栽30d 后, 平均苗高分別為459.99999999999994px和287.5px。因此認(rèn)為, 蛭石+草炭土(1∶1)更適于小苗的生長。孔祥生等[ 7] 認(rèn)為在較低溫度下移栽有利于小苗成活。在15 ℃～ 20 ℃條件下, 以蛭石為基質(zhì), 其移栽成活率(36 %)比25 ℃～ 30 ℃條件下(8 %)提高3.5 倍;在15 ℃～ 20 ℃條件下, 以腐殖土(經(jīng)高壓滅菌)為基質(zhì)的移栽成活率(48 %)可比蛭石的提高33 %, 且移栽苗的生長也比較健壯。安佰義選用的移栽基質(zhì)為園土、珍珠巖、木屑、雞糞、馬糞, 并以2∶2∶3∶2∶1 的比例混合, 嚴(yán)格保持溫度為25 ℃±1 ℃,濕度大于80 %, 移栽苗成活率高達(dá)80 %。

4 問題與展望

國內(nèi)外牡丹的組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)有了一定的基礎(chǔ), 但還沒有形成一個(gè)比較完善的技術(shù)體系, 還不能實(shí)現(xiàn)牡丹的工廠化育苗。其主要原因有:(1)外植體表面滅菌污染率高;(2)培養(yǎng)物容易褐化和玻璃化。

褐化和玻璃化是受多種因素影響的, 如外植體的發(fā)育階段及滅菌方法、基本培養(yǎng)基的類型 、外源激素的濃度、培養(yǎng)時(shí)的光照 和溫度等;(3)繁殖系數(shù)低。目前報(bào)道的牡丹組織培養(yǎng)繁殖系數(shù)一般在2-5 ,無法滿足工廠化育苗的需要;(4)生根培養(yǎng)困難。一是生根率不高, 一些品種甚至尚未獲得生根苗;二是根由苗基部的愈傷組織產(chǎn)生, 使根與莖中間形成離層, 影響下一步的移栽工作;(5)移栽成活率低。一是在移栽過程中容易斷根;二是組培苗移栽階段感病嚴(yán)重和死亡率高。這些都是實(shí)現(xiàn)牡丹工廠化育苗的瓶頸。

在以后的工作中, 要加強(qiáng)牡丹不同品種組織培養(yǎng)技術(shù)體系的研究, 研制出針對不同品種的高效、實(shí)用、標(biāo)準(zhǔn)的組培快繁體系;其次, 在外植體處理及誘導(dǎo)、增殖分化、生根壯苗等各個(gè)階段, 以及在不同培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、培養(yǎng)基添加物的選擇、培養(yǎng)條件等方面對牡丹組培體系需進(jìn)行優(yōu)化。外植體的幼化程度直接影響著組織培養(yǎng)的結(jié)果,而其又與植物的年齡和著生部位關(guān)系密切, 這一點(diǎn)在木本植物的組織培養(yǎng)中表現(xiàn)尤為突出。一般來源于幼年木本植物的外植體比來源于成年的容易培養(yǎng)。如果必須從成年植物上選取外植體時(shí), 應(yīng)考慮從成年植株的下部幼年期的部位取材。外植體的位置效應(yīng), 同時(shí)也適用于幼年樹, 即同株植物體中, 一般較低部位的外植體要比上部位的容易啟動, 培養(yǎng)成功可能性大。

　　因此, 外植體的位置效應(yīng)和年齡效應(yīng)對牡丹組織培養(yǎng)的影響也是今后研究的重要內(nèi)容。此外, 在牡丹組培快繁體系的基礎(chǔ)上, 應(yīng)拓寬研究方向。如通過轉(zhuǎn)基因技術(shù), 在基因水平上改變其性狀表現(xiàn):提高牡丹的抗寒性, 擴(kuò)大牡丹在北方的栽植面積;改變牡丹的花色、延長花期等, 給人們帶來更豐富的視覺感受;矮化植株和縮短根長, 以實(shí)現(xiàn)牡丹由田間種植到室內(nèi)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)變。單倍體育種可與轉(zhuǎn)基因研究相結(jié)合, 獲得單倍體轉(zhuǎn)基因植株后, 進(jìn)行染色體加倍,從而獲得純合的轉(zhuǎn)基因植株, 避免外源基因的沉默。輻射育種能引起遺傳物質(zhì)的突變, 如染色體的畸變、DNA 分子的變異,因此也能夠從基因水平上改變其性狀表現(xiàn)。但目前牡丹的輻射育種研究仍屬空白。今后應(yīng)加強(qiáng)牡丹的輻射育種研究, 有望通過輻射育種得到不同花色、矮化植株、抗性提高的牡丹新品種。