鐵皮石斛( Dendrobiumcandidum) 是一種珍稀名貴的藥用和觀賞植物，是我國重點保護(hù)的瀕危珍稀物種，由于其對生長條件要求比較苛刻，且在自然界中多與真菌共生，因此人工栽培成活率較低、生長緩慢。內(nèi)生真菌( fungal endophytes) 是能夠定殖在植物組織內(nèi)但不引起病害癥狀的真菌，它們與宿主互惠共生，賦予植物優(yōu)良生長性狀。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌對十字花科、禾本科、菊科、茄科和包括鐵皮石斛在內(nèi)的蘭科等不同植物都表現(xiàn)出了較好的促生作用，說明內(nèi)生真菌具有較為廣泛的分布。目前，關(guān)于鐵皮石斛促生研究的內(nèi)生真菌大多來源于鐵皮石斛，很少來自其他宿主植物。內(nèi)生真菌在自然界具有廣泛的宿主范圍，由此我們推測其他植物同樣蘊藏著可能對鐵皮石斛具良好促生功能的內(nèi)生真菌。為了發(fā)掘更多優(yōu)良的對鐵皮石斛有促生作用的內(nèi)生真菌，筆者擬拓寬宿主植物的分離范圍，從山茶科、杜鵑花科等非蘭科植物中分離內(nèi)生真菌，篩選鐵皮石斛優(yōu)良促生菌株，并結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征對其進(jìn)行分類學(xué)鑒定，以期為內(nèi)生真菌在鐵皮石斛生產(chǎn)上的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1． 1 材料

　　山茶( Camellia japonica)、柃木( Eurya japonica)、大果杜鵑( Ｒhododendron) 、大葉杜鵑( Ｒhododendronmucronatum G． Don． ) 、小葉杜鵑( ＲhododendronobtusumPanch． ) 、柑橘( Citrus reticulate) 、八角( Illicium anisatum L． ) 和毛櫻花( Prunus jamasakura)8 種木本植物的莖和葉采自日本茨城大學(xué)農(nóng)學(xué)院校園。鐵皮石斛( Dendrobium candidum) 組培苗為廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供的桂斛1號。

1． 2 菌株分離

　　將新鮮健康的植物的莖和葉分別用流水沖洗表面的塵土，自然晾干，剪切成約0.5 cm× 0.5 cm 大小的片段，每種組織樣隨機取15 個片段用75% 乙醇浸泡15-60s，1 % 次氯酸鈉浸泡1-3 min，無菌水沖洗3 次以上，平放于玉米粉培養(yǎng)基平板上( 玉米粉瓊脂25 g /L; 瓊脂粉15 g /L; 氨芐青霉素50μg /L; 鏈霉素50 μg /L) ，置26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。采用菌絲尖端挑取法，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、生長時間的不同，及時挑取組織塊下或周緣生長的菌絲轉(zhuǎn)接于麥芽汁培養(yǎng)基平板上。

1． 3 內(nèi)生真菌的篩選

　　為了排除致病性菌株和腐生菌株，參照Narisawa等的方法根據(jù)菌落形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)將分離菌株進(jìn)行分組，每組隨機取1 株代表菌株，接種于燕麥培養(yǎng)基平板上，每皿3 個菌塊，培養(yǎng)7-14 d 后備用。白菜種子經(jīng)表面消毒、催芽2 d 后移栽至培養(yǎng)好的菌落上，于光照培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)。以未接種菌株為對照處理，每個處理重復(fù)4 次。14 d 后觀察白菜苗的生長情況，將白菜根部洗凈后放入50 ℃烘箱中烘烤3 d 稱量干質(zhì)量。

1． 4 菌株的分類鑒定

　　1) 菌株形態(tài)學(xué)觀察。將從冰箱取出的菌種接種至馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基( PDA) 上，培養(yǎng)3 周后觀察菌落形態(tài)特征。用插片法將純化的菌株接于燕麥培養(yǎng)基， 25 ℃培養(yǎng)2 ～4 周，待明顯看到菌絲著生在蓋玻片上時，將玻片取出，于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

　　2) 菌株的分子鑒定。采用TaKaＲa MightyAmpDNA Polymerase Ver． 2 試劑盒，挑取麥芽汁平板上的菌絲作為模板直接用于PCＲ 反應(yīng)。采用White等通用引物ITS1/ITS4、NS1 / NS4 兩對引物分別擴(kuò)增菌株的ITS 和18S rDNA 區(qū)域。PCＲ 反應(yīng)體系為: MightyAmp DNA Polymerase ( Ver． 2) 0． 5 μL，buffer 25 μL， 20 μmol /L 正反引物各1 μL，模板DNA1 μL( 挑取少量菌絲) ，用ddH2O定容至50 μL。PCＲ反應(yīng)條件參數(shù)參照試劑盒說明。引物合成和測序均由華大基因科技有限公司完成，測序后登錄Gen-Bank 進(jìn)行比對，采用MEGA 5． 0軟件構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹。

1． 5 菌株與鐵皮石斛組培苗的共培養(yǎng)

　　將供試菌株每皿接種3 個菌塊于燕麥培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)7-14 d 后備用。選擇長勢一致的鐵皮石斛組培苗移栽至菌落上，每個菌落移栽1 株苗，于光照培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)。以未接種菌株為對照處理，每個處理重復(fù)4 次。60 d 后測量株高等生長指標(biāo)，并采用Narisawa 等的表面消毒法對根部內(nèi)生真菌進(jìn)行再分離; 另外進(jìn)行根部石蠟切片和棉蘭染色在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1． 6 菌株與鐵皮石斛盆栽苗的共培養(yǎng)

　　選取長勢一致的鐵皮石斛組培苗，移栽至培養(yǎng)基質(zhì)為樹皮和木屑( 體積比3∶ 1) 的塑料育苗盤中( 規(guī)格為50 cm× 50 cm × 6 cm) ，每叢種植3 株苗，每盤種植9 叢，成活后澆菌液。將菌絲塊接種于PDB 培養(yǎng)基中于搖床振蕩培養(yǎng)( 26 ℃，轉(zhuǎn)速為150r /min) ，培養(yǎng)14 d 后收集菌絲團(tuán)，打碎后配制濃度為5 × 105 cfu /mL 的菌液。菌液30 mL /叢，每隔15 d澆菌液1 次，共澆菌液3 次，以未澆菌液為對照處理，設(shè)4 個重復(fù)。接種后6 個月調(diào)查生長指標(biāo)。

1． 7 統(tǒng)計分析

　　采用Excel 2003 和DPS 6． 55 軟件進(jìn)行分析，試驗數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2． 1 菌株的分離

　　從8 種木本植物的莖和葉共計240 個組織塊分離獲得了204 株真菌，其中分離自山茶、柃木、大果杜鵑、大葉杜鵑、小葉杜鵑、柑橘、八角和毛櫻花的真菌分別為25、16、36、31、36、14、31 和15 株，分離自葉部和莖部的菌株分別占42． 7% 和57． 3%。分離菌株大多數(shù)約4 d 在分離培養(yǎng)基上長出，多數(shù)為擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis( 72． 8%) ，其次為炭疽菌屬Colletotrichum ( 12． 1%) 和擬莖點霉屬Phomopsis( 8．9%) 。

2． 2 內(nèi)生真菌的篩選

　　為了排除病原菌和腐生菌，將分離菌株分成菌落形態(tài)差異明顯的11 個組，每組隨機取1 個代表菌株接種白菜無菌苗。其中5 個代表菌株分離自葉部，6個代表菌株分離自莖部。接種結(jié)果表明11 個代表菌株中只有1 個菌株24L-4(9%) 對白菜沒有表現(xiàn)出致病性，其余的10 個供試菌株(91%) 接種白菜后出現(xiàn)了不同程度的葉片黃化、植株矮小甚至萎蔫，生物量顯著低于對照處理( 圖1) 。菌株24L-4所在組只有24L-41 個菌株，該菌株接種白菜后生物量為( 60． 2 ± 5． 6) mg，較對照處理( 52． 2 ± 4． 2)mg 提高了15． 3% ( 圖1) ; 可見，菌株24L-4對白菜的生長不但沒有表現(xiàn)出負(fù)面影響，反而表現(xiàn)出了促生作用。

2． 3 促生菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

　　菌株24L-4 分離自山茶葉部( 圖2A) 。該菌株在PDA 培養(yǎng)基上生長緩慢，在25 ℃下培養(yǎng)2 周后菌落直徑接近15 mm，菌落接近圓形，鼠灰色，中間絨毛狀，邊緣圓滑、質(zhì)地致密( 圖2B) 。在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 個月后產(chǎn)生分生孢子，菌絲分支有隔，淺褐色，光滑，1～ 4 μm( 平均2 μm) 寬; 分生孢子梗沿著菌絲的蔓延直立產(chǎn)生，偶有彎曲，無分支，褐色，光滑，厚壁，13-275 ( 平均70) μm × 2-4 ( 平均3)μm，1-16 個橫隔; 產(chǎn)孢細(xì)胞位于產(chǎn)孢梗末端，褐色，近圓柱形，光滑，偶有分隔，4-28 ( 平均12)μm × 2 ～4( 平均3) μm; 分生孢子鏈狀，褐色，光滑，近圓柱形、紡錘形或橢圓形，0-1個分隔，4-7( 平均5) μm × 2-4( 平均3) μm( 圖2C-E) 。上述特征與Devriesia lagerstroemiae 的形態(tài)特征基本相符。

2． 4 序列登錄號及系統(tǒng)發(fā)育分析

　　菌株24L-4 的rDNA-ITS 區(qū)域PCＲ 擴(kuò)增獲得1條568 bp 長的序列，GenBank 登錄號為KP197670，在GenBank 中通過Blast 程序進(jìn)行核苷酸序列比對，結(jié)果表明該菌株序列和Devriesialagerstroem( GU214634) 的同源性高達(dá)99%?；谠摫葘Y(jié)果建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3 所示，菌株24L-4 以高達(dá)95%的支持率與Devriesia lagerstroem 單獨聚為一支。此外，采用NS1 和NS4 為引物擴(kuò)增出1 條1073 bp 的序列，GenBank 登錄號為KP197671，Gen-Bank 的核苷酸BLAST 比對結(jié)果表明，菌株24L-4 的18S rDNA 序列和Devriesia lagerstroem( JN938704)序列同源性高達(dá)100%。通過以上對菌株24L-4 的形態(tài)學(xué)、核糖體DNA的ITS、18S 的序列的比對分析，將該菌株確定為Devriesia lagerstroem。

2． 5 菌株24L-4對鐵皮石斛組培苗生長的影響

　　菌株24L-4 接種鐵皮石斛組培苗60 d 后，長勢明顯優(yōu)于無接種對照植株，各生長指標(biāo)的測量結(jié)果見表1。菌株24L-4處理的各個生長指標(biāo)均高于無接種的對照處理，其中葉寬、莖徑、株高和干質(zhì)量值分別較對照增長65． 7%、27． 3%、33． 3%和45． 1%，與對照相比差異顯著。經(jīng)表面消毒再分離，菌株24L-4 在根、莖、葉部組織塊的分離頻率分別為53． 3%、20． 0% 和0． 0%，結(jié)果表明在組織培養(yǎng)條件下，該菌株能夠定殖于鐵皮石斛苗的根部和莖部，根部的分布頻率較莖部高，在葉部沒有分布。在光學(xué)顯微鏡下觀察，除了在維管柱沒有觀察到菌株的定殖結(jié)構(gòu)外，在根部的縱切面觀察到深色有隔菌絲和類似微菌核的定殖結(jié)構(gòu)于細(xì)胞內(nèi)，橫切面的皮層中同樣觀察到這些定殖結(jié)構(gòu)的分布，說明該菌株24L-4不能定殖于鐵皮石斛根部的維管柱，可定殖于外皮層和皮層。

2． 6 菌株24L-4對鐵皮石斛盆栽苗生長的影響

　　菌株24L-4 接種鐵皮石斛盆栽苗6 個月后各生長指標(biāo)的測量結(jié)果見表2，菌株24L-4處理的各個生長指標(biāo)均高于無接種的對照處理，其中鮮質(zhì)量、莖徑和干質(zhì)量與對照的差異達(dá)到了顯著水平，分別較對照增長了83． 9%、104． 0%和114． 7%。

3 討論

　　本研究嘗試從一些非蘭科植物中分離篩選對鐵皮石斛具促生作用的內(nèi)生真菌，并成功獲得了1 株目標(biāo)菌株24L-4。該菌株分離自茶科植物，接種十字花科的白菜、蘭科的鐵皮石斛都表現(xiàn)出了較明顯的促生作用，再次證明了內(nèi)生真菌的宿主范圍和應(yīng)用的廣泛性，也說明了在發(fā)掘內(nèi)生真菌資源時可以考慮拓寬宿主植物的分離范圍。

　　經(jīng)菌落和孢子形態(tài)、ITS-rDNA 和18S-rDNA 序列分析，發(fā)現(xiàn)菌株24L-4 與Devriesia lagerstroem 為同一個種。Devriesia( 德福里斯孢) 建立于2004 年，該屬是第2 個已發(fā)表的耐熱的枝孢類似屬，建屬時包含5 個種( D． acadiensis、D． shelburniensis、D．chlamydospora、D．staurophora 和D． thermodurans)。目前，根據(jù)Index Fungorum 數(shù)據(jù)庫的 很新結(jié)果，該屬名下已報道26 種。該屬的多數(shù)種菌株分離自土壤和耐熱環(huán)境，D． acadiensis、D． staurophora、D．thermodurans 產(chǎn)生的厚垣孢子在75 ℃高溫下暴露30 min 仍能萌發(fā); 少數(shù)種報道分離自植物，如D．lagerstroem 分離自紫薇( Lagerstroemiaindica) ，D． xanthorrhoeae 分離自黑仔樹( Xanthorrhoeaaustralis) ; 可見該屬的生態(tài)分布比較廣泛。

　　D． lagerstroem 于2009 年作為一個新種報道，分離自紫薇，無厚垣孢子，無耐熱功能; 菌株24L-4同樣分離自植物( 山茶花) ，也沒有觀察到厚垣孢子的產(chǎn)生。這是D． lagerstroem作為一種植物促生內(nèi)生真菌的 報道。

　　根據(jù)本文的研究結(jié)果，24L-4 在燕麥培養(yǎng)基和樹皮-木屑栽培介質(zhì)中對鐵皮石斛的組培苗均表現(xiàn)出了良好的促生效果。接種組培苗60 d 后莖徑、干質(zhì)量較對照的增幅分別為27． 3%和45． 1%，而接種盆栽苗6 個月后莖徑、干質(zhì)量的增幅分別達(dá)到了104． 0%和114． 7%，可見該菌株在盆栽條件下表現(xiàn)出更為明顯的促生作用。菌株再分離和根部定殖切片顯微觀察結(jié)果表明，菌株24L-4能成功定殖于鐵皮石斛苗根部的皮層和外皮層，但并沒有對植株的生長造成負(fù)面影響，反而促進(jìn)其生長，說明該菌株與鐵皮石斛苗之間建立了一種共生關(guān)系，具體的共生機制仍需進(jìn)一步探索。

　　綜上，本文從山茶中分離篩選獲得1 株對鐵皮石斛具較好促生作用的內(nèi)生真菌24L-4，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、ITS-rDNA 和18S-rDNA 序列分析將其鑒定為D． lagerstroem。D． lagerstroem 于2009 年被 報道，本文則報道了D． lagerstroem 具有良好的促生功能。該菌株對鐵皮石斛組培苗表現(xiàn)出顯著的促生作用，可用于鐵皮石斛專用菌肥的開發(fā)利用。