桉樹是世界著名的速生豐產(chǎn)用材樹種。我國引種桉樹已經(jīng)有120年的歷史，是廣西、廣東、海南等華南各省的最主要造林樹種，可在平原、臺地、丘陵、低山等地貌的林地種植，是近年來發(fā)展速度較快的樹種。并且，桉樹具有較高的經(jīng)濟價值和廣泛的用途，它是造紙原料的重要來源，它的木材還可以加工成家具，不但質(zhì)量好，而且十分美觀。而桉樹組培的成功，主要解決了一些難以生根的樹種或無法采用扦插方法增繁無性系的繁殖問題，加快優(yōu)良無性系的繁殖速度，桉樹組培苗的生產(chǎn)前景非常廣闊。

PART 1

組培器材

桉樹組織培養(yǎng)是一項技術(shù)性很強的工作，無菌條件要求嚴(yán)格，對實驗室設(shè)備及人員的操作技術(shù)要求較高，組培實驗室應(yīng)配備下列設(shè)備。
　　第一、洗滌設(shè)備：設(shè)置洗滌室、洗滌劑及各種洗滌工具。
　　第二、滅菌設(shè)備：設(shè)置高壓高溫滅菌鍋。
　　第三、化學(xué)實驗設(shè)備：設(shè)置實驗臺架、藥品柜、冰箱、天平、各種、玻璃器皿、PH計、攪拌器等。
　　第四、無菌操作設(shè)備：設(shè)置接種室、超凈工作臺、鑷子、剪刀、解剖刀及酒精燈等。
　　第五、培養(yǎng)設(shè)備：設(shè)置培養(yǎng)室、培養(yǎng)容器、三角瓶、罐頭瓶等。

植物組織培養(yǎng)應(yīng)用的培養(yǎng)基，一般都包括大量元素、微量元素和碳水化合物，并添加各種各樣的附加物，如維生素、氨基酸、生長素、細(xì)胞分裂素等。
　　桉樹芽的誘導(dǎo)可選用N6和MS等作基本培養(yǎng)基、胚狀體的誘導(dǎo)可選用B5H及改良H等作基本培養(yǎng)基。

PART 2

組培流程

目前，桉樹無性系組織多采用外植體直接誘導(dǎo)腋生叢生芽，然后切取足夠長度，長得健壯的小芽轉(zhuǎn)到生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，形成生根植株。采用這種方法，桉樹的遺傳性最穩(wěn)定。

采集對象為桉樹嫁接苗或伐樁、環(huán)割、萌芽條。截取具有半木質(zhì)化程度的嫩梢，長度為5~10cm。試驗證明，3~5月份桉樹萌芽率較高，莖部積累有較豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和內(nèi)源激素，受病蟲侵害較少、外植體誘導(dǎo)成功率最高。7~9月份屬高溫高濕季節(jié)，水分、溫度都較高，病蟲十分活躍，莖段機械損傷較多，易受病、蟲菌的侵害污染，故誘導(dǎo)成功率最低。因此外植體采集最好是在春季進行，以芽條腋芽開始膨大，芽鱗片還未裂開時為最佳時機。芽條在植株上的部位也是誘導(dǎo)芽能否成功的重要因素。試驗證明，萌芽條中上部的莖段，以半木質(zhì)化的莖段第5~第7節(jié)最好，因為較易進行表面滅菌處理，而且不容易褐化，萌芽率也高；過嫩的芽木質(zhì)化程度低，表面滅菌很容易被殺死；過老的莖段表面滅菌時容易褐化而死亡，而且過老的莖段再生能力差而不易萌芽。

將采回的桉樹嫩莖段剪去葉片，用少量洗衣粉水漂洗10分鐘，再用流動水沖洗半小時左右，然后在無菌條件下用75%酒精浸泡5秒鐘，再用新潔爾滅溶液或0.1﹪升汞溶液浸5~6分鐘消毒，用無菌水沖洗4~5次，然后切取含1~2個腋芽的莖段接種在培養(yǎng)基上進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，試驗證明，重復(fù)消毒一次效果更佳。

桉樹莖段接種后，如切口處產(chǎn)生褐色滲出物，使莖段周圍的培養(yǎng)基變成棕褐色，這種現(xiàn)象就叫“褐變”。莖段在培養(yǎng)基內(nèi)變褐色就會失去生命力，導(dǎo)致外植體死亡、嚴(yán)重地影響了外植體誘導(dǎo)的成功率，可采取以下措施綜合防治。

①.盡量避免組織傷害，用于切割的解剖刀應(yīng)盡可能鋒利。

②切割外植體時，應(yīng)當(dāng)把組織浸于水中隔絕空氣，同時，切面要垂直，切口的損傷要減至最低的限度。

③接種時應(yīng)選擇表面消毒過程中沒有損傷的莖段，并注意不讓腋芽附著培養(yǎng)基。

④利用漫射光培養(yǎng)。由于光能提高多氧化酶的活性，從而促進多酚化合物的氧化，因此在弱光下培養(yǎng)，能有效地降低多酚氧化物的氧化。

⑤及時轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，當(dāng)發(fā)生褐變時應(yīng)及時轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，使褐化不影響腋芽周圍的組織，外植體仍有萌動的生命力。

PART 3

增值培養(yǎng)

繼代苗的增殖培養(yǎng)是指將誘導(dǎo)形成的胚狀體、芽叢等轉(zhuǎn)接入培養(yǎng)基內(nèi)，使其產(chǎn)生更多的芽體。

將誘導(dǎo)出的芽體轉(zhuǎn)接到繼代苗培養(yǎng)基里，然后放置于培養(yǎng)室內(nèi)，室溫為25℃——28℃為宜，光照強度為1500——3000LX為佳。過強的光照易使苗木老化，過弱的光照易使苗木徒長，所以控制好光照很重要。經(jīng)過了七天左右的暗培養(yǎng)，即可見萌生出多叢嫩芽，經(jīng)過1——2天的自然光照后，即可開日光燈增強光照。若發(fā)現(xiàn)霉菌及真菌感染的苗，要及時拿去高溫消毒，以免傳染了其他的瓶苗。

玻璃苗：是指由于苗木不能及時見光，苗木木質(zhì)化低。表現(xiàn)為葉片及嫩梢呈現(xiàn)出透明或半透明狀態(tài)，含水量增加，葉片脆弱易碎，這種狀態(tài)的苗木很難增殖及生根，移栽時不易成活。解決辦法：及時見光。苗木進行暗培養(yǎng)七天以后，立即見自然光1——2天，然后即可打開日光燈進行補光。日光燈照一周后即可將瓶苗移到窗口進行煉苗，使其吸收更加強烈的自然光照，以加快苗木的木質(zhì)化程度。

褐化:是由于培養(yǎng)基中的酚類物質(zhì)被氧化，使苗木周圍的培養(yǎng)基呈現(xiàn)褐色。褐化會使苗生長緩慢，也容易變成變態(tài)苗，這樣會影響后面的生根增殖。解決辦法：及時轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基。

PART 4

生根培養(yǎng)

繼代苗經(jīng)過了多次繼代增殖后，會長出許多叢芽，主芽多且明顯，而且芽叢煉至半木質(zhì)化時即可進行大量生根接種，以獲取完整生根植株。進行生根接種時，應(yīng)當(dāng)選取干凈、不帶菌的繼代瓶苗，在超凈工作臺中，用消毒好的剪刀剪取頂芽粗壯，葉片展開良好的半木質(zhì)的一段繼代苗，長度約為1.5厘米，插入生根培養(yǎng)基中。每瓶視情況插入15——20棵苗。生根苗接好后將其置于培養(yǎng)室中，室溫控制在25℃——28℃，與繼代苗的管理方法相同，也是進行七天左右的暗培養(yǎng)，待生根苗基部冒出根以后，即可打開日光燈讓其見光。經(jīng)過兩周左右，待苗木的根長到2——3厘米，葉片充分展開時，即可送至玻璃煉苗棚進行煉苗，使其充分吸收和適應(yīng)自然光線。經(jīng)過十天左右的煉苗，生根苗的根系發(fā)達，葉片和莖段的顏色由淺綠變成深綠，而且長得非常茂盛時，木質(zhì)化程度較高時，即可進行生根苗的移栽。

(1)污染嚴(yán)重造成生根瓶苗污染嚴(yán)重的原因有

①用消毒不徹底的器具進行接種,或者超凈工作臺未擦拭干凈,或者培養(yǎng)基消毒不徹底。

②用作生根接種的繼代苗本身就被真菌或者細(xì)菌感染。

③接種室或者培養(yǎng)室衛(wèi)生狀況差。

針對以上原因，應(yīng)對的辦法是：首先應(yīng)當(dāng)確保接種室和培養(yǎng)室的衛(wèi)生，每天接種前應(yīng)打開紫外線消毒燈進行半小時消毒，室內(nèi)地板應(yīng)當(dāng)保持干凈整潔，超凈工作臺應(yīng)用新潔爾滅擦拭過；其次確保用作接種材料的繼代苗要干凈無污染，接種時接種器具（如剪刀、鑷子、盤子）都應(yīng)進行高壓滅菌，特別是培養(yǎng)基也應(yīng)進行40分鐘左右的消毒。操作的時候，剪刀、鑷子還應(yīng)當(dāng)用消毒器再次進行消毒，時間為3——5分鐘每次。只有每個環(huán)節(jié)都做好，才可以減少污染，降低苗木成本，提高苗木質(zhì)量。

(2)生根率不高生根苗生根率不高，是由于生根激素不足或者不適合；其次是由于接種時選取的芽不好，木質(zhì)化程度不夠或太弱或玻璃化。所以，遇到生根率不高時，應(yīng)當(dāng)及時調(diào)整培養(yǎng)基配方，在接種時也要選取壯苗、優(yōu)質(zhì)苗進行接種。

當(dāng)生根瓶苗煉苗至苗木充分木質(zhì)化、葉片舒展、葉色濃綠、莖軸、根系伸長時即可移栽至育苗袋內(nèi)種植。移栽前用0.15%~0.3%的高錳酸鉀溶液進行基質(zhì)消毒。移栽時，倒出培養(yǎng)基，小心洗去殘留在根上的培養(yǎng)基，并截去過長的根，保留2cm左右，用0.1%的殺菌劑進行小苗消毒處理，根部再經(jīng)IBA生根激素溶液處理后移入育苗基質(zhì)中，然后置于育苗架上，在70%遮光度的蔭棚內(nèi)培育25~30天。移植初期要覆蓋塑料薄膜保溫保濕，等小苗高3cm生長穩(wěn)定后即可進行露天煉苗，當(dāng)小苗長至15~20cm時可以出圃造林。

PART 5

車間管理

接種室是進行組培研究或者組培生產(chǎn)工作最關(guān)鍵的地方，應(yīng)當(dāng)保持干爽安靜、明亮清潔，保持良好的無菌或者低菌狀態(tài)，應(yīng)當(dāng)與外界保持相對隔絕，盡量減少與外界空氣對流，減少粉塵和微生物的侵入。所以，接種室外應(yīng)有緩沖間，并配上密閉的拉門，減少與空氣對流。
    每天接種前應(yīng)先進行接種室的消毒工作，即開紫外線消毒燈照射半個小時，超凈工作臺也應(yīng)當(dāng)使用紫外線消毒燈消毒至少20分鐘，關(guān)閉紫外線燈后使氣體散出后即可開始操作。另外，每十天或者半個月應(yīng)當(dāng)使用40﹪的甲醛加少量高錳酸鉀進行密封熏蒸消毒。
　　接種操作前，應(yīng)用75﹪的酒精或者2.5﹪的新潔爾滅擦拭工作臺、手臂以及進行接種的材料。
　　注意接種室的衛(wèi)生，不得在接種室內(nèi)吃東西，平時每天下班要安排人員清掃接種室，以及及時清理掉不用和污染的接種材料。以減少污染源。
　　接種操作間應(yīng)當(dāng)穿上干凈的工作服、戴口罩、工作帽，出入時應(yīng)當(dāng)換拖鞋，以保持接種室的干凈整潔。

培養(yǎng)室的要求與接種室基本一樣，也需要干凈、整潔、干燥，室溫要保持在25℃——28℃。室內(nèi)要定期消毒，用40﹪的甲醛加少量高錳酸鉀進行密封熏蒸消毒。另外，培養(yǎng)室在設(shè)計時應(yīng)當(dāng)考慮光照問題，墻面以白色為主，窗口盡可能多一些，以利于采光，這樣有利于煉苗。